Publications sur Confocal Laser Scanning Microscopy

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• 1 Thèse de Doctorat et Habilitation
• 2 Rapports de recherche et Rapports techniques

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Thèse de Doctorat et Habilitation

1 - Blind Deconvolution for Confocal Laser Scanning Microscopy. P. Pankajakshan. Thèse de Doctorat, Universite de Nice Sophia Antipolis, décembre 2009. Mots-clés : Confocal Laser Scanning Microscopy, Blind Deconvolution, point spread function, Maximum likelihood estimation , total variation regularization. @PHDTHESIS{PankajakshanThesis09, author = {Pankajakshan, P.}, title = {Blind Deconvolution for Confocal Laser Scanning Microscopy}, year = {2009}, month = {décembre}, school = {Universite de Nice Sophia Antipolis}, url = {http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00474264/fr/}, keyword = {Confocal Laser Scanning Microscopy, Blind Deconvolution, point spread function, Maximum likelihood estimation , total variation regularization} } Résumé : La microscopie confocale à balayage laser, est une technique puissante pour étudier les spécimens biologiques en trois dimensions (3D) par sectionnement optique. Elle permet d’avoir des images de spécimen vivants à une résolution de l’ordre de quelques centaines de nanomètres. Bien que très utilisée, il persiste des incertitudes dans le procédé d’observation. Comme la réponse du système à une impulsion, ou fonction de flou (PSF), est dépendante à la fois du spécimen et des conditions d’acquisition, elle devrait être estimée à partir des images observées du spécimen. Ce problème est mal posé et sous déterminé. Pour obtenir une solution, il faut injecter des connaisances, c’est à dire, a priori dans le problème. Pour cela, nous adoptons une approche bayésienne. L’état de l’art des algorithmes concernant la déconvolution et la déconvolution aveugle est exposé dans le cadre d’un travail bayésien. Dans la première partie, nous constatons que la diffraction due à l’objectif et au bruit intrinsèque à l’acquisition, sont les distorsions principales qui affectent les images d’un spécimen. Une approche de minimisation alternée (AM), restaure les fréquences manquantes au-delà de la limite de diffraction, en utilisant une régularisation par la variation totale sur l’objet, et une contrainte de forme sur la PSF. En outre, des méthodes sont proposées pour assurer la positivité des intensités estimées, conserver le flux de l’objet, et bien estimer le paramètre de la régularisation. Quand il s’agit d’imager des spécimens épais, la phase de la fonction pupille, due aux aberrations sphériques (SA) ne peut être ignorée. Dans la seconde partie, il est montré qu’elle dépend de la difference à l’index de réfraction entre l’objet et le milieu d’immersion de l’objectif, et de la profondeur sous la lamelle. Les paramètres d’imagerie et la distribution de l’intensité originelle de l’objet sont calculés en modifiant l’algorithme AM. Due à la nature de la lumière incohérente en microscopie à fluorescence, il est possible d’estimer la phase à partir des intensités observées en utilisant un modèle d’optique géométrique. Ceci a été mis en évidence sur des données simulées. Cette méthode pourrait être étendue pour restituer des spécimens affectés par les aberrations sphériques. Comme la PSF varie dans l’espace, un modèle de convolution par morceau est proposé, et la PSF est approchée. Ainsi, en plus de l’objet, il suffit d’estimer un seul paramétre libre. Abstract : Confocal laser scanning microscopy is a powerful technique for studying biological specimens in three dimensions (3D) by optical sectioning. It permits to visualize images of live specimens non-invasively with a resolution of few hundred nanometers. Although ubiquitous, there are uncertainties in the observation process. As the system’s impulse response, or point-spread function (PSF), is dependent on both the specimen and imaging conditions, it should be estimated from the observed images in addition to the specimen. This problem is ill-posed, under-determined. To obtain a solution, it is necessary to insert some knowledge in the form of a priori and adopt a Bayesian approach. The state of the art deconvolution and blind deconvolution algorithms are reviewed within a Bayesian framework. In the first part, we recognize that the diffraction-limited nature of the objective lens and the intrinsic noise are the primary distortions that affect specimen images. An alternative minimization (AM) approach restores the lost frequencies beyond the diffraction limit by using total variation regularization on the object, and a spatial constraint on the PSF. Additionally, some methods are proposed to ensure positivity of estimated intensities, to conserve the object’s flux, and to well handle the regularization parameter. When imaging thick specimens, the phase of the pupil function due to spherical aberration (SA) cannot be ignored. It is shown to be dependent on the refractive index mismatch between the object and the objective immersion medium, and the depth under the cover slip. The imaging parameters and the object’s original intensity distribution are recovered by modifying the AM algorithm. Due to the incoherent nature of the light in fluorescence microscopy, it is possible to retrieve the phase from the observed intensities by using a model derived from geometrical optics. This was verified on the simulated data. This method could also be extended to restore specimens affected by SA. As the PSF is space varying, a piecewise convolution model is proposed, and the PSF approximated so that, apart from the specimen, it is sufficient to estimated only one free parameter.

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2 Rapports de recherche et Rapports techniques

1 - Space non-invariant point-spread function and its estimation in fluorescence microscopy. P. Pankajakshan et L. Blanc-Féraud et Z. Kam et J. Zerubia. Research Report 7157, INRIA, décembre 2009. Mots-clés : Confocal Laser Scanning Microscopy, point spread function, Estimation bayesienne, Estimation MAP, Deconvolution, fluorescence microscopy. @TECHREPORT{ppankajakshan09c, author = {Pankajakshan, P. and Blanc-Féraud, L. and Kam, Z. and Zerubia, J.}, title = {Space non-invariant point-spread function and its estimation in fluorescence microscopy}, year = {2009}, month = {décembre}, institution = {INRIA}, type = {Research Report}, number = {7157}, url = {http://hal.archives-ouvertes.fr/inria-00438719/en/}, keyword = {Confocal Laser Scanning Microscopy, point spread function, Estimation bayesienne, Estimation MAP, Deconvolution, fluorescence microscopy} } Résumé : Dans ce rapport de recherche, nous rappelons brièvement comment la nature limitée de diffraction de l'objectif d'un microscope optique, et le bruit intrinsèque peuvent affecter la résolution d'une image observée. Un algorithme de déconvolution aveugle a été proposé en vue de restaurer les fréquences manquants au delà de la limite de diffraction. Cependant, sous d'autres conditions, l'approximation du systéme imageur l'imagerie sans aberration n'est plus valide et donc les aberrations de la phase du front d'onde émergeant d'un médium ne sont plus ignorées. Dans la deuxième partie de ce rapport de recherche, nous montrons que la distribution d'intensité originelle et la localisation d'un objet peuvent être retrouvées uniquement en obtenant de la phase du front d'onde réfracté, à partir d'images d'intensité observées. Nous démontrons cela par obtention de la fonction de ou a partir d'une microsphère imagée. Le bruit et l'influence de la taille de la microsphère peuvent être diminués et parfois complètement supprimes des images observées en utilisant un estimateur maximum a posteriori. Néanmoins, a cause de l'incohérence du système d'acquisition, une récupération de phase a partir d'intensités observées n'est possible que si la restauration de la phase est contrainte. Nous avons utilisé l'optique géométrique pour modéliser la phase du front d'onde réfracté, et nous avons teste l'algorithme sur des images simulées. Abstract : In this research report, we recall briefly how the diffraction-limited nature of an optical microscope's objective, and the intrinsic noise can affect the observed images' resolution. A blind deconvolution algorithm can restore the lost frequencies beyond the diffraction limit. However, under other imaging conditions, the approximation of aberration-free imaging, is not applicable, and the phase aberrations of the emerging wavefront from a specimen immersion medium cannot be ignored any more. We show that an object's location and its original intensity distribution can be recovered by retrieving the refracted wavefront's phase from the observed intensity images. We demonstrate this by retrieving the point-spread function from an imaged microsphere. The noise and the influence of the microsphere size can be mitigated and sometimes completely removed from the observed images by using a maximum a posteriori estimate. However, due to the incoherent nature of the acquisition system, phase retrieval from the observed intensities will be possible only if the phase is constrained. We have used geometrical optics to model the phase of the refracted wavefront, and tested the algorithm on some simulated images.

2 - Parametric blind deconvolution for confocal laser scanning microscopy-proof of concept. P. Pankajakshan et L. Blanc-Féraud et B. Zhang et Z. Kam et J.C. Olivo-Marin et J. Zerubia. Rapport de Recherche 6493, INRIA, avril 2008. Mots-clés : Confocal Laser Scanning Microscopy, Bayesian restoration, Blind Deconvolution, point spread function, Richardson-Lucy algorithm, Variation totale. Copyright : ARIANA/INRIA @TECHREPORT{ppankajakshan08b, author = {Pankajakshan, P. and Blanc-Féraud, L. and Zhang, B. and Kam, Z. and Olivo-Marin, J.C. and Zerubia, J.}, title = {Parametric blind deconvolution for confocal laser scanning microscopy-proof of concept}, year = {2008}, month = {avril}, institution = {INRIA}, type = {Research Report}, number = {6493}, url = {https://hal.inria.fr/inria-00269265}, pdf = {http://hal.inria.fr/docs/00/27/02/92/PDF/report.pdf}, keyword = {Confocal Laser Scanning Microscopy, Bayesian restoration, Blind Deconvolution, point spread function, Richardson-Lucy algorithm, Variation totale} } Résumé : Nous proposons une méthode de restauration itérative d’images de fluorescence CLSM et d’estimation paramétrique de la fonction de flou (PSF) du système d’acquisition. Le CLSM est un microscope qui balaye un échantillon en 3D et utilise une sténopée pour rejeter la lumière en dehors du point de focalisation. Néanmoins, la qualité des images souffre de deux limitations physiques. La première est due à la diffraction due au système optique et la seconde est due à la quantité réduite de lumière détectée par le tube photo-multiplicateur (PMT). Ces limitations induisent respectivement un flou et du bruit de comptage de photons. Les images peuvent alors bénéficier d’un post-traitement de restauration fondé sur la déconvolution. Le problème à traiter est l’estimation simultanée de la distribution 3D de l’échantillon des sources fluorescentes et de la PSF du microscope (i.e. de déconvolution aveugle). En utilisant un modèle de processus physique d’acquisition d’images microscopiques (CLSM), on réduit le nombre de paramètres libres décrivant la PSF et on introduit des contraintes. On introduit aussi des connaissances a priori sur l’échantillon ce qui permet de stabiliser le processus d’estimation et de favoriser la convergence. Des expériences sur des données synthétiques montrent que la PSF peut être estimée avec précision. Des expériences sur des données réelles montrent de bons resultats de déconvolution en comparaison avec le modèle théorique de la PSF du microscope. Abstract : We propose a method for the iterative restoration of fluorescence Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) images with parametric estimation of the acquisition system’s Point Spread Function (PSF). The CLSM is an optical fluorescence microscope that scans a specimen in 3D and uses a pinhole to reject most of the out-of-focus light. However, the quality of the image suffers from two primary physical limitations. The first is due to the diffraction-limited nature of the optical system and the second is due to the reduced amount of light detected by the photomultiplier tube (PMT). These limitations cause blur and photon counting noise respectively. The images can hence benefit from post-processing restoration methods based on deconvolution. An efficient method for parametric blind image deconvolution involves the simultaneous estimation of the specimen 3D distribution of fluorescent sources and the microscope PSF. By using a model for the microscope image acquisition physical process, we reduce the number of free parameters describing the PSF and introduce constraints. The parameters of the PSF may vary during the course of experimentation, and so they have to be estimated directly from the observation data. We also introduce a priori knowledge of the specimen that permits stabilization of the estimation process and favorizes the convergence. Experiments on simulated data show that the PSF could be estimatedwith a higher degree of accuracy and those done on real data show very good deconvolution results in comparison to the theoretical microscope PSF model.

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