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Publications about Confocal Laser Scanning Microscopy
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PhD Thesis and Habilitation |
1 - Blind Deconvolution for Confocal Laser Scanning Microscopy.
P. Pankajakshan. PhD Thesis, Universite de Nice Sophia Antipolis, December 2009.
Keywords : Confocal Laser Scanning Microscopy, Blind Deconvolution, point spread function, Maximum likelihood estimation , total variation regularization.
@PHDTHESIS{PankajakshanThesis09,
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| author |
= |
{Pankajakshan, P.}, |
| title |
= |
{Blind Deconvolution for Confocal Laser Scanning Microscopy}, |
| year |
= |
{2009}, |
| month |
= |
{December}, |
| school |
= |
{Universite de Nice Sophia Antipolis}, |
| url |
= |
{http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00474264/fr/}, |
| keyword |
= |
{Confocal Laser Scanning Microscopy, Blind Deconvolution, point spread function, Maximum likelihood estimation , total variation regularization} |
| } |
Résumé :
La microscopie confocale à balayage laser, est une technique puissante pour
étudier les spécimens biologiques en trois dimensions (3D) par sectionnement
optique. Elle permet d’avoir des images de spécimen vivants à une résolution de
l’ordre de quelques centaines de nanomètres. Bien que très utilisée, il persiste
des incertitudes dans le procédé d’observation. Comme la réponse du système à
une impulsion, ou fonction de flou (PSF), est dépendante à la fois du spécimen
et des conditions d’acquisition, elle devrait être estimée à partir des images
observées du spécimen. Ce problème est mal posé et sous déterminé. Pour
obtenir une solution, il faut injecter des connaisances, c’est à dire, a priori dans le
problème. Pour cela, nous adoptons une approche bayésienne. L’état de l’art des
algorithmes concernant la déconvolution et la déconvolution aveugle est exposé
dans le cadre d’un travail bayésien. Dans la première partie, nous constatons
que la diffraction due à l’objectif et au bruit intrinsèque à l’acquisition, sont les
distorsions principales qui affectent les images d’un spécimen. Une approche
de minimisation alternée (AM), restaure les fréquences manquantes au-delà de
la limite de diffraction, en utilisant une régularisation par la variation totale
sur l’objet, et une contrainte de forme sur la PSF. En outre, des méthodes
sont proposées pour assurer la positivité des intensités estimées, conserver le
flux de l’objet, et bien estimer le paramètre de la régularisation. Quand il
s’agit d’imager des spécimens épais, la phase de la fonction pupille, due aux
aberrations sphériques (SA) ne peut être ignorée. Dans la seconde partie, il est
montré qu’elle dépend de la difference à l’index de réfraction entre l’objet et
le milieu d’immersion de l’objectif, et de la profondeur sous la lamelle. Les
paramètres d’imagerie et la distribution de l’intensité originelle de l’objet sont
calculés en modifiant l’algorithme AM. Due à la nature de la lumière incohérente
en microscopie à fluorescence, il est possible d’estimer la phase à partir des
intensités observées en utilisant un modèle d’optique géométrique. Ceci a été
mis en évidence sur des données simulées. Cette méthode pourrait être étendue
pour restituer des spécimens affectés par les aberrations sphériques. Comme la
PSF varie dans l’espace, un modèle de convolution par morceau est proposé, et la
PSF est approchée. Ainsi, en plus de l’objet, il suffit d’estimer un seul paramétre libre. |
Abstract :
Confocal laser scanning microscopy is a powerful technique for studying
biological specimens in three dimensions (3D) by optical sectioning. It permits
to visualize images of live specimens non-invasively with a resolution of few
hundred nanometers. Although ubiquitous, there are uncertainties in the
observation process. As the system’s impulse response, or point-spread function
(PSF), is dependent on both the specimen and imaging conditions, it should be
estimated from the observed images in addition to the specimen. This problem is
ill-posed, under-determined. To obtain a solution, it is necessary to insert some
knowledge in the form of a priori and adopt a Bayesian approach. The state of
the art deconvolution and blind deconvolution algorithms are reviewed within a
Bayesian framework. In the first part, we recognize that the diffraction-limited
nature of the objective lens and the intrinsic noise are the primary distortions
that affect specimen images. An alternative minimization (AM) approach
restores the lost frequencies beyond the diffraction limit by using total variation
regularization on the object, and a spatial constraint on the PSF. Additionally,
some methods are proposed to ensure positivity of estimated intensities, to
conserve the object’s flux, and to well handle the regularization parameter.
When imaging thick specimens, the phase of the pupil function due to spherical
aberration (SA) cannot be ignored. It is shown to be dependent on the refractive
index mismatch between the object and the objective immersion medium, and
the depth under the cover slip. The imaging parameters and the object’s original
intensity distribution are recovered by modifying the AM algorithm. Due to
the incoherent nature of the light in fluorescence microscopy, it is possible to
retrieve the phase from the observed intensities by using a model derived from
geometrical optics. This was verified on the simulated data. This method could
also be extended to restore specimens affected by SA. As the PSF is space varying,
a piecewise convolution model is proposed, and the PSF approximated so that,
apart from the specimen, it is sufficient to estimated only one free parameter.
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2 Technical and Research Reports |
1 - Space non-invariant point-spread function and its estimation in fluorescence microscopy.
P. Pankajakshan and L. Blanc-Féraud and Z. Kam and J. Zerubia. Research Report 7157, INRIA, December 2009.
Keywords : Confocal Laser Scanning Microscopy, point spread function, Bayesian estimation, MAP estimation, Deconvolution, fluorescence microscopy.
@TECHREPORT{ppankajakshan09c,
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| author |
= |
{Pankajakshan, P. and Blanc-Féraud, L. and Kam, Z. and Zerubia, J.}, |
| title |
= |
{Space non-invariant point-spread function and its estimation in fluorescence microscopy}, |
| year |
= |
{2009}, |
| month |
= |
{December}, |
| institution |
= |
{INRIA}, |
| type |
= |
{Research Report}, |
| number |
= |
{7157}, |
| url |
= |
{http://hal.archives-ouvertes.fr/inria-00438719/en/}, |
| keyword |
= |
{Confocal Laser Scanning Microscopy, point spread function, Bayesian estimation, MAP estimation, Deconvolution, fluorescence microscopy} |
| } |
Résumé :
Dans ce rapport de recherche, nous rappelons brièvement comment la nature limitée de diffraction de l'objectif d'un microscope optique, et le bruit
intrinsèque peuvent affecter la résolution d'une image observée. Un algorithme de déconvolution aveugle a été proposé en vue de restaurer les fréquences manquants au delà de la limite de diffraction. Cependant, sous d'autres conditions, l'approximation du systéme imageur l'imagerie sans aberration n'est plus valide et donc les aberrations de la phase du front d'onde émergeant d'un médium ne sont plus ignorées. Dans la deuxième partie de
ce rapport de recherche, nous montrons que la distribution d'intensité originelle et la localisation d'un objet peuvent être retrouvées uniquement en obtenant de la phase du front d'onde
réfracté, à partir d'images d'intensité observées. Nous démontrons cela par obtention de la fonction de ou a partir d'une microsphère imagée. Le bruit et l'infl uence de la taille de la
microsphère peuvent être diminués et parfois complètement supprimes des images observées en utilisant un estimateur maximum a posteriori. Néanmoins, a cause de l'incohérence du système d'acquisition, une récupération de phase a partir d'intensités observées n'est possible que si la restauration de la phase est contrainte. Nous avons utilisé l'optique géométrique
pour modéliser la phase du front d'onde réfracté, et nous avons teste l'algorithme sur des images simulées. |
Abstract :
In this research report, we recall briefly how the diffraction-limited nature of an optical microscope's objective, and the intrinsic noise can affect the observed images' resolution. A blind deconvolution algorithm can restore the lost frequencies beyond the diffraction limit. However, under other imaging conditions, the approximation of aberration-free imaging, is not applicable, and the phase aberrations of the emerging wavefront from a specimen immersion medium cannot be ignored any more. We show that an object's location and its original intensity distribution can be recovered by retrieving the refracted wavefront's phase from the observed intensity images. We demonstrate this by retrieving the point-spread function from an imaged microsphere. The noise and the influence of the microsphere size can be mitigated and sometimes completely removed from the observed images by using a maximum a posteriori estimate. However, due to the incoherent nature of the acquisition system, phase retrieval from the observed intensities will be possible only if the phase is constrained. We have used geometrical optics to model the phase of the refracted wavefront, and tested the algorithm on some simulated images. |
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2 - Parametric blind deconvolution for confocal laser scanning microscopy-proof of concept.
P. Pankajakshan and L. Blanc-Féraud and B. Zhang and Z. Kam and J.C. Olivo-Marin and J. Zerubia. Research Report 6493, INRIA, April 2008.
Keywords : Confocal Laser Scanning Microscopy, Bayesian restoration, Blind Deconvolution, point spread function, Richardson-Lucy algorithm, Total variation.
Copyright : ARIANA/INRIA
@TECHREPORT{ppankajakshan08b,
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| author |
= |
{Pankajakshan, P. and Blanc-Féraud, L. and Zhang, B. and Kam, Z. and Olivo-Marin, J.C. and Zerubia, J.}, |
| title |
= |
{Parametric blind deconvolution for confocal laser scanning microscopy-proof of concept}, |
| year |
= |
{2008}, |
| month |
= |
{April}, |
| institution |
= |
{INRIA}, |
| type |
= |
{Research Report}, |
| number |
= |
{6493}, |
| url |
= |
{https://hal.inria.fr/inria-00269265}, |
| pdf |
= |
{http://hal.inria.fr/docs/00/27/02/92/PDF/report.pdf}, |
| keyword |
= |
{Confocal Laser Scanning Microscopy, Bayesian restoration, Blind Deconvolution, point spread function, Richardson-Lucy algorithm, Total variation} |
| } |
Résumé :
Nous proposons une méthode de restauration itérative d’images de fluorescence
CLSM et d’estimation paramétrique de la fonction de flou (PSF) du système d’acquisition.
Le CLSM est un microscope qui balaye un échantillon en 3D et utilise une sténopée pour
rejeter la lumière en dehors du point de focalisation. Néanmoins, la qualité des images
souffre de deux limitations physiques. La première est due à la diffraction due au système
optique et la seconde est due à la quantité réduite de lumière détectée par le tube
photo-multiplicateur (PMT). Ces limitations induisent respectivement un flou et du bruit
de comptage de photons. Les images peuvent alors bénéficier d’un post-traitement de
restauration fondé sur la déconvolution. Le problème à traiter est l’estimation simultanée
de la distribution 3D de l’échantillon des sources fluorescentes et de la PSF du microscope
(i.e. de déconvolution aveugle). En utilisant un modèle de processus physique
d’acquisition d’images microscopiques (CLSM), on réduit le nombre de paramètres libres
décrivant la PSF et on introduit des contraintes. On introduit aussi des connaissances a
priori sur l’échantillon ce qui permet de stabiliser le processus d’estimation et de favoriser
la convergence. Des expériences sur des données synthétiques montrent que la PSF peut
être estimée avec précision. Des expériences sur des données réelles montrent de bons
resultats de déconvolution en comparaison avec le modèle théorique de la PSF du microscope. |
Abstract :
We propose a method for the iterative restoration of fluorescence Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) images with parametric estimation of the acquisition system’s Point Spread Function (PSF). The CLSM is an optical fluorescence microscope that scans a specimen in 3D and uses a pinhole to reject most of the out-of-focus light. However, the quality of the image suffers from two primary physical limitations. The first is due to the diffraction-limited nature of the optical system and the second is due to the reduced amount of light detected by the photomultiplier tube (PMT). These limitations cause blur and photon counting noise respectively. The images can hence benefit from post-processing restoration methods based on deconvolution. An efficient method for parametric blind image deconvolution involves the simultaneous estimation of the specimen 3D distribution of fluorescent sources and the microscope PSF. By using a model for the microscope image acquisition physical process, we reduce the number of free parameters describing the PSF and introduce constraints. The parameters of the PSF may vary during the course of experimentation, and so they have to be estimated directly from the observation data. We also introduce a priori knowledge of the specimen that permits stabilization of the estimation process and favorizes the convergence. Experiments on simulated data show that the PSF could be estimatedwith a higher degree of accuracy and those done on real data show very good deconvolution results in comparison to the theoretical microscope PSF model. |
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